Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒 分子生物試劑
Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒
如要對基因組學和轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)進行可靠比較，則需從同一樣本中純化DNA和RNA。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit使用的溶解方法，從福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣本中純化DNA和RNA。純化產(chǎn)物適用于real-time PCR和焦磷酸測序等應(yīng)用。
從FFPE樣本中純化DNA和RNA。
[A] 從多個大鼠FFPE組織樣本中純化基因組DNA并儲存于室溫。使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（專用于從FFPE樣本中純化DNA的試劑盒，作為對照）進行純化，兩種試劑盒都含有RNase消化試劑。采用吸光度測定方法檢測每個20 μm組織切片的DNA產(chǎn)量。[B] 從多個大鼠FFPE組織樣本中純化RNA并儲存于室溫。使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或RNeasy FFPE Tissue Kit（專用于從FFPE樣本中純化DNA的試劑盒，作為對照）進行純化。采用吸光度測定方法檢測每個10 μm組織切片的RNA產(chǎn)量。從FFPE組織中純化DNA或RNA時，AllPrep Kit的表現(xiàn)與專用的純化試劑盒表現(xiàn)相當。
對預(yù)擴增的cDNA進行芯片分析。
使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit從人類乳腺FFPE組織中純化總RNA。然后使用RT2 FFPE PreAMP技術(shù)進行逆轉(zhuǎn)錄。使用Human Cell Cycle RT2 Profiler PCR Array，通過real-time PCR進行基因表達分析，將腫瘤樣本與非腫瘤樣本進行對比。ΔΔCT分析顯示：腫瘤樣本中的基因表達與非腫瘤樣本的基因表達存在x倍的差異。
對FFPE樣本中的DNA和RNA進行可靠擴增。
使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或?qū)Ｓ糜趶腇FPE樣本中純化DNA或RNA的試劑盒（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 或RNeasy FFPE Kit，作為對照）從大鼠FFPE組織中純化獲得[A] DNA 和[B]、[C] RNA。在ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System上，使用[A] QuantiTect SYBR® Green PCR Kit對78 bp的Prnp基因擴增子進行Real-time PCR分析，或是用[B]、[C] QuantiTect SYBR® Green RT-PCR Kit對Jun原癌基因表達進行real-time RT-PCR分析。AllPrep Kit和另外兩個專用試劑盒的CT值相當，表明三種試劑盒純化DNA或RNA的效率相當。[C] 此外，在沒有逆轉(zhuǎn)錄酶（–RT）的條件下分析了Jun基因的表達。脾臟是富含DNA的組織，其擴增曲線平坦，說明純化的RNA中不含基因組DNA。
AllPrep DNARNA FFPE樣本純化步驟。
Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit專為從FFPE樣本中同時純化基因組DNA和總RNA而設(shè)計。該試劑盒可使用同一樣本純化DNA和RNA，而非像其他純化方法那樣，需將樣本分為兩份再分別進行純化操作。如將樣本分為兩份分別純化DNA和RNA，其純化出的DNA和RNA來自不同的細胞群落，可能具有不同性質(zhì)特征。從同一樣本中同時純化DNA和RNA可減少浪費，因為FFPE樣本是十分珍貴的樣本，通常很難恢復(fù)且樣本量少。
由于固定和包埋，F(xiàn)FPE樣本中的核酸通常都嚴重片段化，核酸的分子量通常小于從新鮮或冷凍樣本中分離出的核酸的分子量。從同一FFPE樣本中分離DNA和RNA面臨著很大困難：片段化的DNA長度短，且部分是單鏈結(jié)構(gòu)；因此其更像RNA，而非完整的DNA。片段化DNA這一特性使得用物理方法分離DNA和RNA十分困難。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit使用的溶解方法，從同一個FFPE樣本中分別釋放DNA和RNA。
盡管標準的質(zhì)量控制分析（如凝膠電泳或芯片分析方法）無法檢測到甲醛的化學修飾，但其對酶分析有嚴重干擾。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit已經(jīng)過優(yōu)化，可zui大程度上逆轉(zhuǎn)甲醛化學修飾，而不引起DNA和RNA的進一步降解。
盡管AllPrep DNA/RNA FFPE Kit已經(jīng)過優(yōu)化，可zui大程度上逆轉(zhuǎn)福爾馬林化學修飾，而不引起DNA和RNA的進一步降解；但從FFPE樣本中純化獲得的核酸不應(yīng)該用于需要大分子量DNA或完整長度RNA的下游應(yīng)用。一些應(yīng)用可能需要進行化學修飾后，再使用片段化核酸（如：設(shè)計PCR和RT-PCR的小擴增子）。在cDNA合成中，應(yīng)使用基因特異性引物，而非oligo-dT引物。如果無法使用基因特異性引物，則可使用任意引物。
特點 | 參數(shù) |
| Applications | PCR, qPCR, real-time RT-PCR, microarray |
| Elution volume | RNA: 14-30µl ; DNA: 30-100µl |
| Format | Spin column |
| Main sample type | FFPE tissue samples |
| Number of preps per run | 50 |
| Processing | Manual (centrifugation) |
| Purification of total RNA, miRNA, poly A+ mRNA, DNA or protein | RNA (miRNA) and DNA |
| Sample amount | max. 4*10 µm sections or 2*20 µm sections |
| Technology | Silica technology |
| Time per run or per prep | 6h for 10 samples, including sectioning |
| Yield | Varies |
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